通过维持细胞表面性质，与嗜盐四生球菌共培养提高了鲁氏接合酵母菌的乙醇耐受性
——四川大学吴重德教授课题组
///////////////
近日，四川大学吴重德教授课题组在国际期刊《FoodMicrobiology》在线发表题为“Co-culturewithTetragenococcushalophilusimprovedtheethanoltoleranceofZygosaccharomycesrouxiibymaintainingcellsurfaceproperties"的研究论文。姚尚杰为一作，吴重德教授为通讯作者，四川大学轻工科学与工程学院为第一完成单位。
●研究背景
醇是挥发性的风味化合物，与发酵食品的质量密切相关，作为发酵食品中存在的最高含量的乙醇，通常导致正常的细胞膜结构改变，特别是磷脂组分中断导致生长抑制和最终细胞死亡。据报道，在乙醇胁迫下，大肠杆菌中色氨酸、组氨酸、支链氨基酸等氨基酸的生物合成途径上调，个基因参与碳水化合物代谢、细胞壁或细胞膜的生物合成，在乙醇处理的运动发酵单胞菌中，呼吸链等有差异表达。
在一些发酵食品的生产过程中，乙醇的积累不仅对非生产乙醇的微生物造成了压力，而且对包括酵母在内的生产乙醇微生物也产生了压力。为了应对乙醇胁迫，酵母采用各种防御机制，包括细胞脂质组合物中的改变，保护物质的积累，关键基因的差异表达。例如当面对10%乙醇时，酿酒酵母中单不饱和脂肪酸的比例随着饱和脂肪酸的减少而增加。据报道，在耐乙醇突变体的研究中，保护物质如脯氨酸、过氧化氢酶、甘油和海藻糖在应激条件下大量积累。转录组分析表明，糖酵解和线粒体功能相关基因的表达上调有利于酿酒酵母的耐酒精性，液泡功能的维持对耐酒精性有重要意义
鲁氏接合酵母和嗜盐四联球菌普遍存在，并在传统发酵食品的风味形成中发挥积极作用。除了快速生长和高效发酵能力之外，耐受环境压力的能力是微生物在发酵过程中的重要因素。在我们之前的研究中，在12%盐水环境中，与嗜盐四联球菌共培养增加了鲁氏乳杆菌的生存能力。RNA-seq技术显示RNA-seq技术显示，与嗜盐四生球菌共培养时，鲁氏接合酵母中参与肌动蛋白组装、ATP合酶、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及蛋白质合成的基因表达存在差异。在本研究中，我们研究了与嗜盐四联球菌共培养对鲁氏接合酵母乙醇耐受性的影响，并通过生理学和转录组学分析阐明了共培养的保护机制。这些结果有助于进一步阐明微生物对环境胁迫的耐受机制和提高食品发酵效率。
1.共培养提高了鲁氏酵母的乙醇耐受性
图1：不同含量乙醇培养90min后的鲁氏酵母存活率(A)和8%乙醇不同培养时间共培养的鲁氏酵母存活率(B)
在这项研究中，研究了与嗜盐菌共培养对鲁氏酵母乙醇耐受性的影响(图1)。根据结果(图1A)，在用5%和7%乙醇干预后，存活率约为90%。当乙醇含量增加到8%时，共培养的鲁氏酵母存活率为23.4%，显著高于单培养的鲁氏酵母存活率(6.2%)。用9%或10%乙醇处理后，通过共培养生长的鲁氏酵母的存活率仍然显著高于通过单培养生长的鲁氏酵母。为了进一步研究共培养时间对鲁氏酵母乙醇耐受性的影响，用8%乙醇处理通过共培养和单一培养生长的鲁氏酵母(图1B)。随着共培养时间从0小时增加到6小时，共培养的酵母存活率从11.9%增加到39.1%。共培养的鲁氏酵母存活率明显高于单培养的鲁氏酵母。对于通过单一培养生长的鲁氏酵母，存活率在6%至10%之间。这些结果表明，与嗜盐菌共培养能够提高鲁氏酵母的乙醇耐受性，且耐受性随着共培养时间的增加而提高。
2.共培养改变了胞内海藻糖和氨基酸的含量，但没有改变鲁氏酵母的麦角甾醇含量
图2：鲁氏酵母细胞中海藻糖含量(A)和鲁氏酵母细胞内麦角甾醇含量(B)
表1：8%乙醇干预后共培养和单培养的鲁氏酵母细胞内氨基酸含量
如图2A所示，在共培养和单培养中生长的鲁氏酵母中海藻糖的含量分别为1.14±0.09mg/mg蛋白质和1.24±0.04mg/mg蛋白质。经8%乙醇处理90min后，共培养的鲁氏酵母海藻糖含量达到1.58±0.05mg/mg蛋白，显著高于单培养的海藻糖含量(1.40±0.01mg/mg蛋白)。结果表明，乙醇胁迫导致海藻糖含量增加，共培养细胞的海藻糖含量高于单培养细胞。
在共培养和单一培养中生长的鲁氏酵母的麦角甾醇含量没有观察到明显的差异。
如表1所示，在鲁氏酵母细胞中总共检测到18种氨基酸。在未经乙醇处理的样品中，共培养的鲁氏酵母细胞中天冬氨酸、苏氨酸、色氨酸和脯氨酸的含量显著高于单培养的鲁氏酵母细胞。乙醇干预90分钟后，细胞内氨基含量显著减少。与单培养的鲁氏酵母细胞相比，共培养的鲁氏酵母细胞显示出较高的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸的含量。
3.共培养有利于保持鲁氏酵母细胞膜的完整性
图3：8%乙醇干预前后鲁氏酵母FDA/PI染色结果(A:乙醇处理前单培养细胞B:乙醇处理前共培养细胞C:乙醇处理后的单培养细胞D:乙醇处理后共培养的细胞)和鲁氏酵母细胞的细胞膜完整性率。
用激光扫描共聚焦显微镜测定乙醇干预和共培养对鲁氏酵母细胞膜完整性的影响。图3显示了鲁氏酵母的FDA/PI染色结果和膜完整性率。图像(图3A-D)显示嗜盐四联球菌被染成红色，具有完整膜和失去膜完整性的鲁氏酵母细胞分别被染成绿色和红色。乙醇干预后，失去膜完整性的鲁氏酵母细胞比例增加。在没有乙醇的情况下，在单一培养物中生长的鲁氏酵母细胞的膜完整性速率低于在共培养物中生长的鲁氏酵母细胞的膜完整性速率(图3E)。乙醇处理后，单培养组和共培养组的细胞膜完整性比率均下降，共培养细胞的细胞膜完整性比率明显高于单培养细胞。这些结果表明乙醇的存在导致了鲁氏酵母膜的损伤，并且与以前的报道一致。
4.共培养有助于保持鲁氏酵母的细胞表面特性
图4：AFM
在未经乙醇处理的单培养组和共培养组中，在高斯曲线FWHM的最大高度(半最大值处的全宽)处获得的杨氏模量值分别为.03±.91Mpa(A，峰I)、.49±.89Mpa(A，峰II)和.42±.04Mpa(B，峰I)、.53±.25Mpa(B，峰II)。在乙醇处理下，单培养组和共培养组的FWHM高斯曲线最大高度处的杨氏模量分别为.81±.40Mpa(C，峰I)、.10±.09Mpa(C，峰II)和.24±.94Mpa(D，峰I)、.83±.71Mpa(D，峰II)。因此，在乙醇胁迫的单一培养样品中，杨氏模量呈现出窄的高斯曲线。结果表明，乙醇胁迫导致鲁氏酵母的刚度降低，而与嗜盐菌共培养有助于细胞保持强健的细胞壁。与单培养细胞相比，在共培养中生长的鲁氏酵母的表面形态似乎更光滑(图4E)。此外，乙醇处理使单培养和共培养的鲁氏酵母细胞粗糙度分别增加了约1.2倍和1.6倍。
5.鲁氏酵母对乙醇干预的响应及共培养对转录谱的影响
表2：鲁氏酵母基因表达
图5：基于log2Foldchange的DEGs热图。S:在单一培养基中生长，C:在共培养条件下生长，SE:在单一培养基中生长，然后用8%乙醇处理。CE:鲁氏酵母在共培养中生长，然后用8%乙醇处理
在乙醇处理后，在共培养和单一培养中生长的鲁氏酵母中，大多数基因的表达降低。准确地说，共培养样品中个基因表达下调，个基因表达上调，单培养样品中个基因表达下调，个基因表达上调。对于细胞成分本体，主要涉及细胞、细胞部分、细胞器和细胞器部分的基因在胁迫后差异表达。在分子功能上，DEGs主要分为催化活性和结合活性。
表2显示KEEG富集分析的基因表达和描述。根据基于log2Foldchange(图5)的DEGs的热图，乙醇处理后在酵母细胞中参与包括脂肪酸生物合成、脂肪酸延伸、类固醇生物合成、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、各种类型的N-聚糖生物合成、肌醇磷酸代谢、MAPK信号通路和紧密连接在内的通路的一些基因的表达下调。与单培养的鲁氏酵母细胞相比，共培养细胞中参与该途径的一些基因表现出较高的表达水平，并且这些基因中的一些在乙醇处理后在共培养细胞中仍然具有较高的表达。这些高表达的基因可能在鲁氏酵母的乙醇耐受性中提供有用的功能。
6.DEGs的RT-qPCR验证
图6：RNA-Seq和RT-PCR的Log2折叠变化值的相关性
如图6所示，在四种不同的比较中(C对S，SE对S，CE对E和CE对SE)，每个基因都具有来自RNA-Seq和RT-PCR的接近的Log2折叠改变值。核酸序列数据和逆转录聚合酶链反应数据之间有很好的相关性。
●结论
鲁氏酵母对包括乙醇胁迫在内的的环境耐受性与发酵食品生产过程中的活力和发酵性能有关。本研究探讨了与嗜盐四链球菌共培养对鲁氏酵母耐乙醇胁迫的影响，结果表明，共培养提高了鲁氏酵母的耐乙醇能力。此外，共培养导致了一种全球性的调节，并且在乙醇胁迫期间发生了许多变化，尤其是在细胞表面。采用生理学和转录组学相结合的方法阐明了共培养的保护机制，结果表明，与嗜盐四链球菌共培养时，鲁氏接合酵母细胞保持了较好的细胞表面特性。本研究的结果可能有助于提高细胞的耐受性和了解乳酸菌和酵母之间的相互作用。
原文链接：
